Prestaciones

Citometría

Este laboratorio presta apoyo técnico a usuarios interesados en las áreas que le son propias.

  • Estudio de viabilidad técnica y entrenamiento en la utilización de citómetros de flujo y programas para análisis de datos.
  • Análisis de ciclo celular en muestras frescas, criopreservadas o incluidas en parafina por citometría de flujo.
  • Estudio biparamétrico de ciclo celular y antígenos de proliferación por citometría de flujo.
  • Estudio multiparamétrico de poblaciones celulares por citometría de flujo. Inmunofenotipado.
  • Estudio de apoptosis.
  • Sorting.
  • Análisis FISH en interfase o metafase con una o dos sondas específicas.

Secuenciación

La instrumentación existente en el Laboratorio de Secuenciación es la más avanzada que se comercializa en la actualidad y permite varias aproximaciones al análisis del ADN de distintos organismos.

Fundamentalmente se pueden aplicar dos metodologías: secuenciación de ADN y genotipado mediante el análisis del tamaño de fragmentos generados por PCR (AFLPs, SNP's, SSCP's, Microsatélites, etc.).

Para facilitar a los usuarios no expertos el empleo de estas técnicas, la Unidad de Secuenciación dispone de un servicio de soporte técnico.

Soporte Técnico

La Unidad cuenta con personal experto en las áreas de secuenciación y de desarrollo y utilización de marcadores moleculares en estudios poblacionales y de identificación de especies.

La colaboración de dicho personal se centra por una parte en el estudio de la viabilidad técnica de las distintas ideas propuestas por los usuarios y por otra en una asesoría tanto en la selección y diseño de marcadores como en la interpretación de los resultados obtenidos.

Esta colaboración se presta de manera gratuita y tiene como única finalidad el permitir el acceso a estas metodologías al mayor número de usuarios posible permitiendo de esta manera la integración de estas técnicas en el ámbito de su actividad.

Para solicitar este servicio puede ponerse en contacto con el personal responsable del mismo a través del teléfono 985 10 96 13 o de la dirección de correo electrónico secuenciacion@spi.uniovi.es

Secuenciación de ADN

Mediante la secuenciación automática se obtiene la secuencia de nucleótidos de una muestra de ADN, el cual puede estar clonado en un vector o haber sido directamente amplificado por PCR.

En la Unidad se encuentran disponibles dos sistemas de análisis de datos que permiten obtener lecturas de hasta 550 y hasta 950 bases respectivamente.

Para la realización de las secuencias se utiliza la química más avanzada disponible (BigDye(r) Terminator v3.1) que ofrece unas prestaciones mejoradas sobre otras químicas a la hora de secuenciar muestras difíciles. Además esta química genera datos con una altura de picos uniforme que permite una asignación más precisa de las bases para la detección de mutaciones y heterocigotos.

Todas las muestras son purificadas mediante columnas de exclusión antes de ser analizadas con el fin de eliminar el ruido de fondo y los terminadores sobrantes colaborando en la obtención de unas muestras con altura de picos uniforme que permite una asignación más precisa. Se recomienda a los usuarios no expertos consultar la guía de preparación de muestras.

Genotipado de ADN

Mediante las técnicas de genotipado, se pueden visualizar uno o múltiples fragmentos de ADN amplificados simultáneamente, obteniéndose de este modo patrones de bandas que pueden ser específicos para cada especie o que presenten variabilidad entre los individuos de una determinada especie.

Entre las metodologías que permiten este genotipado podemos destacar el empleo de loci microsatélites, AFLP's, SNP's y SSCP's. Todas estas metodologías son susceptibles de ser analizadas a través de la instrumentación existente en la Unidad de Secuenciación.

Campos de aplicación

Entre los campos de aplicación más relevantes de estas técnicas se encuentran los siguientes:

  • Investigación básica en Genética Molecular: Estudios filogenéticos y de evolución de los organismos.
  • Investigación básica en Ecología Molecular: Estudios poblacionales, identificación de especies en estadios larvarios, marcado genético de individuos para estudios de campo, etc.
  • Biomedicina: Caracterización molecular de genes con relevancia clínica, susceptibilidad genética a ciertos tipos de cáncer, detección de mutaciones en oncogenes, etc.
  • Genética humana: Diagnóstico de enfermedades hereditarias. Consejo genético.
  • Medicina legal: Identificación de individuos, prueba de paternidad.
  • Microbiología: Identificación de especies bacterianas, identificación de virus.
  • Veterinaria: Pedigrees, identificación de genes de interés en programas de mejora, conservación de especies en peligro de extinción, sexado de aves, etc.
  • Agroalimentación: Identificación de variedades en vegetales, trazabilidad, detección de fraude (identificación de la especie/s presentes en la muestra).

Sexado de Aves

Sexado de un yaco

A partir de una pequeña muestra de plumas o sangre del ejemplar se puede extraer ADN suficiente para averiguar su sexo de manera 100% fiable.

La técnica se basa en la amplificación de ciertas zonas de interés del ADN mediante PCR: una situada en el cromosoma Z (presente en el macho y la hembra) y otra en el cromosoma W (exclusivo de las hembras). A continuación se utiliza un sistema de electroforesis capilar para la detección de los productos obtenidos. En el caso de los machos se obtendrá un sólo producto correspondiente al cromosoma Z (ZZ) y en el caso de las hembras se obtendrán dos: uno correspondiente al cromosoma Z y otro al cromosoma W (ZW).

El resultado se obtiene en 2 días a partir de la recepción de las muestras. Para el envío de las mismas el usuario debe ponerse en contacto previamente con el personal de la Unidad.

La tarifa de sexado es de 15 € por ejemplar.

Prueba de paternidad

PCR en tiempo real

Biotecnología y cultivos celulares

Los servicios que ofrece esta Unidad se enumeran a continuación:

  • Generación de antisueros policlonales de conejo y purificación de la fracción lgG.
  • Generación de hibridomas y anticuerpos monoclonales de ratón
  • Cultivos de líneas celulares así como posibilidad de uso de la sala de cultivos para usuarios autorizados
  • Realización y asesoramiento en el diseño y análisis de ensayos de citotoxicidad y proliferación celular.
  • Monitorización de cultivos celulares a tiempo real con el sistema xCELLigence (Nuevo desde Julio 2011)
  • Biobanco de líneas celulares. (Se ofrece la posibilidad de comprar células a petición de investigadores a ATCC)
  • Purificación de proteínas con el cromatógrafo ÄKTA FPLC.
  • Criopreservación de muestras biológicas.
  • Asesoramiento y apoyo en técnicas de biología molecular

Biobanco de líneas celulares

Línea celular Origen
HL-60Leucemia promielocítica
Caco-2Adenocarcinoma epitelio colorrectal
Sp2/0Mieloma (ratón)
Hep-3BCarcinoma hepatocelular
HeLaAdenocarcinoma Cuello de útero
PANCCarcinoma pancreático
Bx PC-3Carcinoma pancreático
CAPANAdenocarcinoma pancreas
RajiLinfoma Burkitt
Saos-2Osteosarcoma
LOVOCarcinoma colon
Colo 205Carcinoma colon
A2780Carcinoma Ovario
HT29Adenocarcinoma colon
NIH-3T3Fibroblastos ratón embrionario
MDA-MB-231Adenocarcinoma mama
A549Carcinoma alveolar
H116Carcinoma colon
A204Rabdomiosarcoma
Jurkat (Clone E6.1)Leucemia Células T
T98GGlioblastoma
AGSAdenocarcinoma gástrico
MDCKRiñón canino
SW1353Condrosarcoma
GaMGGlioblastoma
SK-MEL-2Melanoma
TK-6Linfoblastoide B
L5178YLinfoblastos murinos
SH-SY5YNeuroblastoma
HT-1080Fibrosarcoma
SK-LMS-1Leiomisarcoma
NCI-H661Carcinoma pulmón

Además disponemos de los siguientes materiales generados en la Unidad.

Available materials from Laboratorio de Biotecnología y cultivos celulares, SCTs Universidad de Oviedo, Spain

Materials Cost Delivery time
100 µg of purified recombinant pneumolysin (PLY) (1,2,3,4)
Expression and purification of recombinant PLY.pdf
300 € +shipment costsAny time
100 µg of monoclonal anti-pneumolysin antibody PLY-4 or PLY-7 (1,3)150 € +shipment costsAny time
100 µg of anti-pneumolysin polyclonal rabbit IgG (2,3)150 € +shipment costsAny time

100 µg of monoclonal anti-pneumococcal C-polysaccharide backbone antibody 101E5.13 (5)

150 € +shipment costsAny time

100 µg of monoclonal anti-phosphorylcholine antibody PSC1.912 (5)

150 € +shipment costsAny time
100 µg of anti- Mouse IgG polyclonal rabbit IgG (NUEVO 2014)150 € +shipment costsAny time

These materials can be supplied at any amount upon request.

This purified recombinant PLY is highly hemolytic and is recognized in Western-blot by monoclonal antibodies PLY-4, PLY-5 and PLY-7 (see Figure). It is supplied in 50 mM TBS, pH 7.5; its concentration has been estimated by absorbance at 278 nm according to an extinction coefficient (?) of 1.36 cm2 /mg.

References

(1) De los Toyos JR, Méndez FJ, Aparicio JF, Vázquez F, Del Mar García Suárez M, Fleites A, Hardisson C, Morgan PJ, Andrew PW, Mitchell TJ. 1996. Functional analysis of pneumolysin by use of monoclonal antibodies. Infect. Immun. 64: 480-484.

(2) Cima-Cabal MD, Méndez FJ, Vázquez F, García-Suárez MM, de los Toyos JR. 2001. A specific and ultrasensitive chemiluminescent sandwich ELISA test for the detection and quantitation of Streptococcus pneumoniae pneumolysin. J Immunoassay Immunochemistry 22: 99-112.

(3) Suárez-Álvarez B, García-Suárez M del M, Méndez FJ, de los Toyos JR. 2003. Characterisation of mouse monoclonal antibodies for pneumolysin: fine epitope mapping and V gene usage. Immunology Letters 88: 227-239.

(4) Solovyova AS, Nöllmann M, Mitchell TJ, Byron O. 2004. The solution structure and oligomerization behavior of two bacterial toxins: pneumolysin and perfringolysin O. Biophys J. 87:540-552.

(5) Férnandez-Sánchez A, García-Ocaña M, de los Toyos JR. 2009. Mouse monoclonal antibodies to pneumococcal C-polysaccharide backbone show restricted usage of VH-DH-JH gene segments and share the same kappa chain. Immunology Letters. 123: 125-131.

Figure 1

Coomassie Blue gel and western blot

Coomassie Blue-stained gel (lane 1) and Western-blots of purified recombinant PLY, 3 µg per lane, with mouse monoclonal antibodies PLY-4 (lane 2), PLY-5 (lane 3) and PLY-7 (lane 4); a PLY-irrelevant mouse monoclonal antibody 1.4G8.66 served as control (lane 5).

Figure 2

Coomassie Blue-stained gel and Western-blots:

  1. Molecular weight markers
  2. Lysate from S. pneumoniae R36A
  3. Lysate from S. mitis SK598
  4. Lysate from S. pneumoniae CSR-SCS2 Clone 1

1 2 3 4 1 2 3 4

SDS-PAGE PSC1.912

SDS - PAGE 10% Western Blot with PSC1.912

Enlaces rápidos

El equipamiento de estas instalaciones está cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), con la gestión del Ministerio de Economía y Competitividad.

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